Definição e importância do problema

Perante a complexidade de determinadas patologias, os clínicos confrontam-se frequentemente com certas limitações quanto à sensibilidade e especificidade dos métodos laboratoriais clássicos utilizados para o diagnóstico. Por outro lado, em tais circunstâncias, segundo a experiência de investigadores, os referidos métodos são marcadores tardios da lesão de órgão.

No final do século XX, após a sequenciação do genoma humano, foram desenvolvidas novas metodologias – cuja designação termina com o sufixo “ómica” – representando a chamada Biologia dos sistemas. Com tal modalidade, torna-se possível a identificação e quantificação em simultâneo, de número significativo de metabólitos celulares (biomarcadores).

Trata-se, pois, duma nova área da ciência (Ciência das ómicas) em franca expansão, com o propósito de se proceder ao estudo integrado das moléculas que compõem um organismo.

As “ómicas” abrangem áreas ou níveis de complexidade diversa mas interdependente, tais como: – a genómica e a transcriptómica, relacionadas respectivamente com os genes (ADN) e a sua expressão (ARN); – a proteómica, relacionada com as proteínas; e a metabolómica, área emergente da bioquímica analítica que identifica e quantifica os produtos intermédios ou finais das vias metabólicas (metabólitos, moléculas de baixo peso molecular). Uma vez que os metabólitos representam a expressão do genoma, transcriptoma e proteoma, os mesmos poderão reflectir o fenótipo de um organismo ou determinadas patologias em tempo real.

A Epigenética – interface entre a genética e os factores ambientais – estudando as modificações do genoma que podem ser transmitidas hereditariamente (alterações moleculares, designadamente metilação ou modificação das histonas, sem alteração da sequência dos nucleótidos do ADN) veio salientar a importância da regulação metabólica do ADN, regulação que pode ser avaliada e monitorizada precisamente através da metabolómica.

Através da metabonómica, variante da metabolómica, procede-se à avaliação em tempo real de determinado perfil metabólico em resposta a determinados estímulos como fármacos, nutrientes, exposição ambiental, etc..

No âmbito da comunidade científica, é consensual que a metabolómica é actualmente, a área das “ómicas” com maior utilidade na prática clínica pediátrica no que respeita especificamente à descoberta de biomarcadores, ao diagnóstico, prognóstico, e à avaliação dos efeitos de fármacos.

O objectivo deste capítulo é uma abordagem sucinta dos principais aspectos da metabolómica na perspectiva da aplicação à clínica pediátrica.

Aspectos metodológicos e limitações

Os vários aspectos da metodologia do estudo metabolómico estão resumidos no fluxograma que integra a Figura 1.

FIGURA 1. O processo da metodologia nos estudos metabolómicos (adaptado de MH Hanna & PD Brophy, 2015).

Salienta-se que é fundamental:

I – a correcta execução sequencial destes “passos” para evitar resultados enviezados;

II – garantir a validação correcta dos mesmos para evitar conclusões erradas.

As análises metabolómicas podem aplicar-se a qualquer tipo de amostras de produtos biológicos (urina, plasma, soro, sangue do cordão umbilical, saliva, ar exalado, fezes, líquido sinovial, tecidos em biópsias, etc.).

A urina é o fluido que mais frequentemente tem sido utilizado, com diversas vantagens, designadamente: – método de colheita não invasivo; – possibilidade de obter informação metabólica mais alargada, holística. Destas características decorre o seu especial interesse em Pediatria e Neonatologia.

A metabolómica utiliza actualmente tecnologias analíticas de elevada sensibilidade e especificidade como a cromatografia gasosa (GC) ou líquida (LC) associada a espectrometria de massa (GC-MS ou LC-MS), e a espectroscopia de ressonância magnética (NMR).

As plataformas mais frequentemente utilizadas em metabolómica apenas identificam espectros de moléculas cuja separação foi obtida com base na sua carga/ massa (espectrometria de massa, MS) ou nas propriedades magnéticas de átomos como 1H ou 13C (NMR).

A identificação dos metabólitos pode ser feita posteriormente através da utilização de bases de dados, como por exemplo a Human Metaboloma Database Metabolite, que associa espectros de MS e de NMR a metabólitos específicos e a vias metabólicas. Estas bases de dados incluem também referências a concentrações dos metabólitos em diferentes fluidos biológicos.

Os resultados analíticos (perfis de metabólitos) são submetidos a complexa análise estatística multivariada, sendo que o número de metabólitos submetidos a estudo pode ultrapassar várias dezenas ou centenas.

O conjunto dos vários metabólitos identificados (combinados e integrados num algoritmo único, interpretado de forma unificada), integra as chamadas “assinaturas”, na gíria dos investigadores.

As “assinaturas” são assim designadas por se assemelharem às vulgares assinaturas, reconhecíveis apenas no seu todo e por poderem contribuir para uma caracterização (metabólica) mais personalizada de cada indivíduo.

As mesmas podem ser comparadas a um código de barras (cada barra, cada metabólito): no seu conjunto é fornecida informação relevante, conquanto cada barra, como peça única, possa não ter significado.

Limitações

Apesar de se tratar duma área do conhecimento muito promissora, na fase actual verificam-se ainda algumas limitações relacionadas:

  • Com as características da tecnologia (equipamentos muito sofisticados e muito caros);
  • Com os recursos humanos (ainda escassos, exigindo-se elevado grau de diferenciação);
  • Ausência de definição dos valores de referência nalgumas áreas, entre o normal e patológico, o que constitui limitação acrescida no caso do organismo em idade pediátrica, caracterizado por variações dos metabolomas com o tempo, face ao crescimento e desenvolvimento; e
  • Falta de estandardização.

Áreas de investigação e aplicações práticas

No quadro 1 são enumeradas as áreas em que a investigação em metabolómica tem sido mais activa.

QUADRO 1. Áreas de investigação metabolómica em Perinatologia e Pediatria.

Medicina FetalRestrição do crescimento
Exposição a agentes infecciosos
Idade gestacional
Peso de nascimento
Prematuridade

Pediatria Neonatal – Neonatologia

Asfixia perinatal
Doenças hereditárias do metabolismo
Fibrose quística
Nutrição

Pediatria Geral

Agressividade
Anorexia nervosa
Asma
Neuro-psicopatias/Autismo
Hiperactividade e défice de atenção
Diabetes
Displasia broncopulmonar
Doença celíaca
Doença inflamatória intestinal
Enterocolite necrosante
Espondilite anquilosante
Fibrose quística
Nefro-uropatias
Defeitos congénitos cardíacos
Microbioma intestinal
Subnutrição
Obesidade e excesso de peso
Obstipação
Oncologia
Sepsis
Susceptibilidade a infecções

 

Citam-se a seguir alguns exemplos concretos de investigação em metabolómica, com aplicações práticas, designadamente quanto a decisões clínicas.

→ Análises em amostras de sangue do cordão umbilical:

  • Diferenças no perfil de aminoácidos e de outros metabólitos entre recém-nascidos (RN) com peso adequado para a idade gestacional e com restrição do crescimento intrauterino; entre RN de baixo peso e de peso normal; e entre RN pré-termo e de termo;
  • Diferenças entre gémeos monocoriónicos e bicoriónicos;
  • Diferenças entre RN com e sem quadro de asfixia perinatal, permitindo compreender a patogénese da adaptação à vida extrauterina (amostras de sangue do cordão);
  • Previsão da evolução clínica de RN com quadro de infecção congénita por CMV (citomegalovírus).

→ Análises em amostras de urina:

  • Diferenças entre RN com persistência de PDA (ductus arteriosus patente) quanto a necessidade, ou não, de profilaxia com anti-inflamatório (ibuprofeno) e, em caso positivo, previsão da resposta ao fármaco.

→ Análises em amostras de lavado broncoalveolar:

  • Diferenças quanto ao perfil de metabólitos do lavado broncoalveolar de RN com síndroma de dificuldade respiratória, pré- e pós-administração de surfactante.

Dados da investigação recente apontam para a comprovação de “assinaturas” compostas de biomarcadores que podem ser mais úteis na fenotipagem da asma e na selecção de tratamentos personalizados, comparativamente a estratégias baseadas em biomarcadores únicos.

A metabolómica da diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) tem revelado aspectos curiosos. Demonstrou-se que as alterações da regulação do metabolismo dos lípidos e aminoácidos precedem o processo de seroconversão da autoimunidade pancreática.

Quanto ao papel da metabolómica e da metabonómica em nutrição na idade pediátrica, salienta-se a sua importância na identificação, a curto prazo, de marcadores de estado nutricional e, a longo prazo, na personalização do regime alimentar a recomendar.

Em medicina materno-fetal, as provas científicas mais interessantes dizem respeito à identificação de “assinaturas” metabolómicas urinárias das grávidas, preditivas do crescimento fetal. Acresce a possibilidade de intervenção precoce em contexto de factores de risco modificáveis como o estilo de vida das grávidas, por forma a alterar o metabolismo materno e, assim, a reduzir o risco de doença no recém-nascido.

No âmbito da avaliação de fármacos (fármaco-metabolómica) cabe citar, entre outros, os estudos preditivos do metabolismo e toxicidade de drogas, assim como a descoberta dos mecanismos de idiossincrasia.

A prevalência da asma na população pediátrica e o seu impacte, a diversidade de fenótipos e de prognóstico, assim como as limitações das terapêuticas farmacológicas, são alguns dos factores que justificam o maior desenvolvimento desta área. Há resultados encorajadores na aplicação da metabolómica, em tempo real e com dispositivos portáteis, dirigida à análise de compostos orgânicos voláteis.

O quadro 2 sintetiza alguns estudos de metabolómica em amostras líquidas obtidas por colheitas não invasivas relacionados com a asma em diversas populações pediátricas.

QUADRO 2 – Resumo dos estudos de metabolómica em amostras líquidas obtidas por colheitas não invasivas na asma em diversas populações pediátricas.

População (n)Amostra
(Método)		Metabólitos identificados com potencial capacidade discriminativaBibliografia
(n) = nº de indivíduos investigados; EBC = utilizando condensado do ar exalado; LC-MS = por cromatografia líquida associada a espectrometria de massa; NMR = por ressonância magnética nuclear.
Controlo saudável (25)
Asma (33)		EBC
(LC-MS)		Metabólito da prostaglandina, prostaglandina D2, leucotrieno C4, ácido 5-hidroxieicosatetraenóico.Glowacka E, et al, 2013
Controlo saudável (15)
Asma não grave (31)
Asma grave (11)		EBC
(LC-MS)		Ácido retinóico, deoxiadenosina, calcitriol, 20-hidroxi-prostaglandina F2alfa, tromboxano B2 e 6-ceto-prostaglandina F1alfa.Carraro S, et al, 2013
Controlo saudável (24)
Asma (65)		Saliva
Urina
(NMR)		Saliva: arginina, aspartato, citrato, taurina.
Urina: ácido butírico, ácido glucónico, ácido pantoténico, ácido quinolínico, lisina, pseudouridina.		(Pité L, et al – dados não publicados)
Asma controlada com corticosteróides (15)
Asma sem resposta a corticosteróides (15)		Urina
(LC-MS)		Gama-glutamilcisteína, cisteína-glicina, ácido 3,6-di-hidronicotínico, 3,4-di-hidroxi-fenilalanina, 3-metoxi-4-hidroxifenil (etileno)glicol.Park YH, et al, 2016
Controlo saudável (12)
Asma (41)		Urina
(LC-MS)		Ácido urocânico, ácido metil-imidazoleacético, dipéptido isoleucina-prolina.Mattarucchi E, et al, 2012
Controlo saudável (42)
Asma controlada (53)
Asma agudizada (20)		Urina
(NMR)		1-Metil-histamina, 1-metilnicotinamida, 2-oxoglutarato, 3-metiladipato, 4-amino-hipurato, O-acetilcarnitina, fenilalanina, triptofano, etc..Saude EJ, et al, 2011
Asma agudizada sob budesonida e salbutamol (69) ou placebo (48)Urina
(NMR)		Urina: cis-aconitato, lactato, 2-deoxyinosina, 3-metilhistidina, ácido 5-hidroxiindoleacético, 2-aminoadipato, glicose, citrulina, homoserina, histamina, alanina, asparagina, glicilprolina, snglicero-3-fosfocolina, sarcosina, ornitina, creatina, creatinina, glicina, isoleucina and trimetilamine N-óxidoQuan-Jun Y, et al, 2017

Conclusão

Sobre metabolómica, área em grande expansão, existem já na actualidade muitos estudos, particularmente no campo da asma. Salienta-se o interesse desta disciplina em Pediatria, considerando a utilização de amostras biológicas obtidas por métodos não invasivos, designadamente a partir do ar exalado, saliva e/ou urina.

Tendo em conta algumas limitações, torna-se obrigatório proceder à padronização no desenho dos estudos para a validação dos resultados em diferentes populações.

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